凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理及其消化、蒸餾
以凱氏定氮法測定氮含量換算蛋白質(zhì)的方法，是國際上通用的標(biāo)準(zhǔn)方法，操作簡單，測定結(jié)果重復(fù)性和重現(xiàn)性都很好，廣泛用于各種食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測定。此法又分為常量、半微量、微量法三種。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為半微量凱氏定氮法。其測定原理相同，主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多。而微量法則具有實驗規(guī)模小，實驗費用低的優(yōu)點。但微量法的準(zhǔn)確度和精密度比常量法要差一些。凱氏定氮法整個測定過程分為消解、蒸餾、滴定三步。凱式定氮法包括消化爐和蒸餾裝置，它們的結(jié)合能夠讓實驗盡可能的簡單�！ �
要使測定結(jié)果有更好的正確度、準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度，認(rèn)真細(xì)致掌握測定的每個步驟、各個細(xì)節(jié)及相應(yīng)的注意事項，就顯得尤為重要�！�
實驗過程操作
1、主要試劑的配制
40%氫氧化鈉：化學(xué)純400g氫氧化鈉溶于1000ml無氨蒸餾水中。
2%硼酸：分析純20g硼酸溶于1000ml無氨蒸餾水中。
0.05mol/L鹽酸：分析純4.2ml鹽酸定容至1000ml，通過無水碳酸鈉標(biāo)定。
混合指示劑：把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚綠溶液5份和溶于95%乙醇的0.l%
甲基紅溶液1份混合而成.
2、實驗過程注意事項
(1)樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。
固體樣品一般取樣范圍為0.20g~2.00g;半固體試樣一般取樣范圍為2.00g~5.00g;液體樣品取樣10.0mL~25.0mL(約相當(dāng)?shù)?0mg~40mg)。若檢測液體樣品，結(jié)果以g/100mL表示。
樣品應(yīng)是均勻的。固體樣品應(yīng)預(yù)先研細(xì)混勻，液體樣品應(yīng)振搖或攪拌均勻。
(2)樣品放入定氮瓶內(nèi)時，不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結(jié)果偏低，或者用濾紙包裹好一起投入消化，濾紙影響通過空白扣除。消化時應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數(shù)滴過氧化氫后，再繼續(xù)加熱消化至完全。
(3)消化時，不要用強火。若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產(chǎn)生。在整個消化過程中保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。海能公司消解爐SH220或SH520能夠很好的解決此問題。
(4)如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當(dāng)硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量;加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點;催化劑硫酸銅在有機物全部消化后，溶液顯清澈透明的藍綠色，可用它來指示消化終點。此外，硫酸銅還可用做下一步蒸餾時堿性反應(yīng)的指示劑。過氧化氫，為氧化劑，有助于有機物消化，同時可以消除消化過程中的氣泡現(xiàn)象。
(5)向蒸餾器瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀物，這是由于分解促進堿與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀。有時銅離子與氨作用，生成深蘭色的結(jié)合物[Cu(NH3)4]2 ，加入氫氧化鈉是否足量,常常影響整個測定的順利進行。由反應(yīng)原理可知，當(dāng)氫氧化鈉足量時有黑色氧化銅生成而使溶液呈淡黑色;當(dāng)氫氧化鈉量不足時就無黑色氧化銅產(chǎn)生而使溶液呈淡藍色，所以有無氧化銅顏色存在是判斷氫氧化鈉是否足量的標(biāo)志。
(6)因蒸餾時反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得�；饠鄽�，否則，會發(fā)生倒吸。停止蒸餾時，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層，所以，操作時，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源。蒸餾是否完全，可用精密PH試紙測冷凝管口的冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾完全。一般情況下建議使用半微量法，因為如果蒸餾失敗的話，半微量法還可繼續(xù)蒸餾，而常量法只好全部重來，費時費力。我們使用海能K9840經(jīng)過多次蒸餾吸收實驗達到理想效果。
(7)混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。
(8)吸收液也可以用0.01當(dāng)量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N堿液滴定，而以硼酸為氨的吸收液，可省去標(biāo)定堿液的操作，且硼酸的體積要求并不嚴(yán)格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。另外，硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結(jié)果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。
(9)在鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制時，必須將基準(zhǔn)無水碳酸鈉于270-300℃灼燒至恒重后稱取所須用量，否則也會影響蛋白質(zhì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，常量法中取0.1M比較合適，半微量法中則在0.02～0.05M之間比較合適。
